A：
转膜时一般采用恒流模式，虽然电压也可以作为转膜的控制参数，但在实际操作中，由于电压过高可能导致发热量增加、胶烧焦等问题，因此更推荐使用恒流模式进行转膜。电流大小通常在150mA~300mA之间。转膜时间需根据目的蛋白的大小、胶的浓度和厚度进行调整。大分子蛋白，转膜时间可能需要延长至数小时甚至过夜。
A：
转膜方法——湿转是转大分子量蛋白质时常用的方法。对温度的控制较好，不容易出错，但操作相对复杂，且耗费转膜液较多。
转膜液成分——转膜液中的甲醇浓度可以影响转膜效率。对于250kD以上的大分子蛋白，甲醇浓度可以降至5%~20%，具体浓度需根据实验条件进行优化。在转膜缓冲液中加入0.1%SDS可以提高转膜效率，但需注意SDS可能对某些膜材料（如PVDF膜）的转膜效果产生影响，需根据实际情况进行尝试。
膜材料选择——PVDF膜韧性好、蛋白结合能力更强，适用于大分子量蛋白质的转膜。但使用前需要用甲醇或乙醇进行活化。
转膜条件——对于250kD以上的大分子蛋白，转膜时间可能需要延长至数小时。例如，有实验者采用300mA恒流转膜2.5小时获得了良好的转膜效果。
Q：
可以同时转大蛋白和小蛋白吗？实验条件设置 ？
A：
可以一起选择转膜，大分子量蛋白（> 150 kDa）推荐使用5% 的甲醇。通常认为100KDa以上的蛋白为大蛋白，其他为小蛋白。对于大蛋白，湿转是更佳的选择。
A：
PVDF膜比较贵,但是做WB的"杀手锏”，与硝酸纤维素膜相比, PVDF膜在蛋白质截留能力,机械强度和化学相容性上都更优越的性能。
A：
在进行磷酸化蛋白检测时建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂,封闭时间不宜过程,1-1.5h即可。 为尽量减少非特异性信号,用 TBST 代替磷酸盐缓冲液(PBS)。裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,因为组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶,它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化,否则即使条带压出来也会很浅,结果也不可信。
A：
5%脱脂牛奶封闭效果最佳,但有时也可能封闭过度,过度会导致目标信号微弱，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。
A：
封闭时间过长、封闭液浓度过高、封闭液选择不当以及实验条件不当可能会出现封闭过度的情况。
A：
NC膜（硝酸纤维素膜）是亲水性的，能够自然地与水性溶液相互作用，因此不需要使用甲醇进行预处理。NC膜的蛋白质结合主要依靠疏水作用和氢键作用，这种结合方式使得背景染色较低。相比之下，PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）具有较强的疏水性，需要甲醇来降低表面张力，使其更容易被水性转膜缓冲液湿润，从而提高蛋白质的转印效率。然而，这种处理过程可能会导致更高的背景染色。
A：
常温孵育，孵育时间相对较短，通常在2至4小时内即可完成，适合紧急情况下的实验需求。且与膜上抗原的结合比较快，同时抗体与杂蛋白的结合也会增加，可能导致非特异性条带增多。此外，常温孵育可能会缩短一抗的使用寿命。4度过夜孵育，温度较低时，抗原和抗体的结合反应较为缓慢，但结合效果比较好，非特异性条带也比较少，可以优先选择4度过夜孵育。
A：
重新煮样不会加速蛋白降解。在进行Western Blot（WB）实验时，许多研究者会在上样前再次煮蛋白，这主要是出于以下几个原因：排除沉淀风险：从冰箱中取出的蛋白样本可能会产生沉淀，煮一下可以确保样本均匀。促进SDS与蛋白质的结合：SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，高温处理能够显著提高SDS与蛋白质的结合效率，确保蛋白质完全变性和解聚，便于后续蛋白质分子量大小的分离。破坏蛋白质的高级结构：煮沸处理能够破坏蛋白质的二级、三级和四级结构，使其转变为线性结构，这样蛋白质在电泳时的迁移率仅与分子量大小有关，而不是电荷差异。灭活蛋白酶：煮沸处理是一种有效的灭活蛋白酶的方法，能够确保蛋白质在电泳过程中保持完整，提高样品稳定性：煮沸处理能够提高蛋白样品的稳定性，确保实验条件一致性，从而提高实验结果的可靠性和重复性。因此，重新煮样不会加速蛋白降解，反而有助于确保实验的准确性和重复性。
Q：
我的蛋白是150kD，可以选择多大的分离胶？
A：
对于分子量较大的蛋白质（例如150kDa），可以使用6%的分离胶。
Q：
某个分泌型蛋白，只能用快速封闭液才能孵育发光显出，用BSA或者牛奶都发不出来，是什么原因？
A：
可能是bsa或牛奶溶解不完全或者封闭液蛋白存放时间太久。
A：
1. 样本处理：
在细胞裂解过程中，蛋白酶和磷酸酶会被释放出来，可能会影响检测结果。为了防止蛋白降解或修饰，可以将样本置于冰上，并使用预冷的缓冲液。同时，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂也是非常必要的。
2.样本上量
磷酸化蛋白的丰度通常较低，大概只有总蛋白量的10%，甚至更低，这可能会导致在 Western blot 实验中检测到的信号较弱。为了获得清晰的磷酸化条带，增加每个孔上的蛋白量是一个常见的策略。
3. 检测总蛋白含量
为确定 WB 上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。
4. 抗体选择 选择针对磷酸化蛋白的特异性抗体，并确保其质量和适用性。抗体的稀释倍数也需要适当调整，以确保最佳的检测效果。
5. 封闭剂选择：
避免使用牛奶作为封闭剂，因为牛奶中含有大量的磷酸化酪蛋白，可能会影响磷酸化抗体对靶蛋白的结合。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。
A：
磷酸化蛋白的检测不一定非要使用BSA进行封闭，但BSA作为一种常用的、有效的封闭液成分，在多数情况下是合适的选择。
A：
乙醇和甲醇是两种常用的有机溶剂，它们在转膜过程中都具有较好的挥发性，有利于裂解蛋白质和进行溶液的净化。但它们也有一些区别。首先，乙醇的挥发性较差，难以完全蒸发，而甲醇在常温下易挥发，所以使用甲醇的转膜膜片干燥速度较快。
Q：
有一些体内表达量较低的蛋白，颜色比较浅，背景经常会干扰他的结果，这个如何改善优化呢？
A：
需要从样本处理、实验条件、实验技术、减少背景干扰以及其他注意事项等多个方面入手。比如提高样本质量，优化裂解条件，选择高特异性、高亲和力的抗体，优化抗体浓度等。
